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第1篇：堅定的錫兵范文

劉某于2006年經老鄉(xiāng)介紹來到了山西省某縣的一家煤礦公司當了一名井下工人。雖說下井又累又危險，但每個月四五千的工資，干別的是不可能掙到的，劉某也沒啥技術，他就想趁著還有把子力氣，多攢點錢供孩子上學。2011年12月的一天晚上，正在井下的工作面打錨桿時，劉某的衣服不慎絞在了鉆桿上，還沒等他反應過來，錨頭已經重重打到了胸脯上。劉某當時就覺得胸疼得厲害，井下的班長趕緊讓其他人扶著他升井，然后送到了就近的煤礦醫(yī)院。經診斷，劉某右側第八肋軟骨骨折。當時公司支付了住院期間的醫(yī)療費，劉某聽別人說還應該有別的賠償，但他還想繼續(xù)在公司上班，因此沒有向公司提出賠償。劉某繼續(xù)上班后，胸部一直疼的厲害，自己買了止疼藥也沒管用，他覺得奇怪，按照醫(yī)生的說法，他現(xiàn)在恢復的還不錯，應該不至于這么疼了，劉某有點擔心，就自己來到了醫(yī)院又做了次檢查，診斷結果為：肺大泡、肺氣腫。醫(yī)生一看檢查結果，就問他是干什么的，得知劉某一直在井下工作，醫(yī)生就說該病很可能是因為長期在井下吸入有害氣體所致，如果再發(fā)展下去那就是矽肺病了。原本以為下井工作就是累點臟點，有危險也是瓦斯爆炸、塌方和透水等事故，沒想到還有矽肺病。醫(yī)生說這個病很嚴重，如果不及時治療會有生命危險?；氐焦竞?，劉某就去找公司領導，提出給自己治療，卻遭到了領導的拒絕。無奈之下，劉某在工友的指點下，來到了農民工工作站求助。

律師了解情況后，告訴劉某，他肋骨受傷和肺部的職業(yè)病都屬于工傷，但由于傷害的性質不一樣，所以需要分別處理。律師首先整理好相關材料后向社會保障局提出了工傷認定，要求認定劉某肋骨骨折為工傷；至于職業(yè)病的工傷認定，需要先經過職業(yè)病診斷才行。由于劉某當時肋骨受傷有很多工人在場，公司為他支付了醫(yī)療費，對受傷的事實也不否認，因此劉某肋骨骨折的工傷認定很快就做出了。拿到工傷認定書后，劉某卻一點也高興不起來，因為此時他的肋骨骨折已經基本痊愈，但肺部的毛病卻越來越嚴重，而此時他還不知道自己該去哪里做職業(yè)病診斷。律師四處打聽后，得知山西省職業(yè)病醫(yī)院可以做職業(yè)病診斷，律師就幫助劉某將材料遞交給了醫(yī)院，但醫(yī)院檢查后認為劉某缺少有關勞動關系、工種、工作崗位等單位證明，因此拒絕為其作職業(yè)病診斷。律師提出，劉某肋骨骨折已經確認了工傷，工傷證上也表明了他的工作單位，勞動關系已經認定，為什么不能做職業(yè)病診斷？但醫(yī)院方面認為，除了確認目前的勞動關系外，用人單位必須要出具工種、工作時間等具體工作資料。劉某很失望，這些東西自己哪能拿的來??？律師考慮后，提出一方面讓他繼續(xù)就肋骨骨折申請勞動能力鑒定；另一方面，則向勞動仲裁委提出申請，要求確認他與公司的勞動關系、工種、工作崗位及時間。很快，劉某肋骨骨折經鑒定為九級傷殘，而仲裁委經審理后也做出了裁決書：確認了劉某與公司存在勞動關系，并對其工作崗位和工作時間也做出了認定。收到仲裁裁決書后，律師整理了材料再次遞交給了職業(yè)病醫(yī)院。醫(yī)院做出了職業(yè)病診斷，確認劉某為煤工塵肺一期。根據這一診斷證明，社會保障局做出了工傷認定，確認劉某所患的職業(yè)病為工傷。原本以為沒辦法的事，在律師的幫助下柳暗花明竟然拿到了工傷證。劉某這下有信心了，在律師的幫助下討要自己應得的賠償。

律師提醒：職業(yè)病是工傷的一種情形，但申請工傷認定前，必須先經過有資質的醫(yī)療機構進行職業(yè)病診斷，而職業(yè)病診斷需要勞動關系、工作崗位、工作時間等資料。農民工朋友若認為自己可能患職業(yè)病，就要先收集相關證據，尤其是確認勞動關系的證據。

摘自《農民工法律援助中心》

第2篇：堅定的錫兵范文

(一)列舉式職業(yè)病目錄與經濟發(fā)展要求不相適應

目前，我國職業(yè)病鑒定機構根據《職業(yè)病分類和目錄》采用列舉式進行認定，2013年出臺新的《職業(yè)病分類和目錄》，與2002年《職業(yè)病目錄》相比，其法定職業(yè)病目錄雖增加18種，達到132種，但仍采用列舉式認定方式和適用范圍基本上限于工業(yè)生產領域。這也就是說，還有相對多的一部分與職業(yè)活動相關的類職業(yè)病，如頸椎病、肩周炎、鼠標手等疾病并不在我國現(xiàn)行職業(yè)病目錄保護范圍之列，而類職業(yè)病正呈逐漸蔓延開來的趨勢。特別是新技術的應用、新工藝的改進，新的職業(yè)病所帶來的危害也將不斷出現(xiàn)，近年己發(fā)現(xiàn)巧種新的職業(yè)病，將繼續(xù)威脅著勞動者身體健康乃至生命安全。

(二)職業(yè)病潛伏的時間長以致錯過最佳鑒定時間

職業(yè)病具有兩個特點，一是職業(yè)病具有滯后性。由于勞動關系的不穩(wěn)定，大多數(shù)勞動者不得不根據福利待遇和用工環(huán)境候鳥式的遷徙到各個用工區(qū)域，由于職業(yè)病具有一定的潛伏期，勞動者很可能在更換2~3個工作單位后，才逐漸發(fā)現(xiàn)自己患了職業(yè)病，而在此時，大多數(shù)勞動者由于無法確定究竟在哪一家企業(yè)接觸有毒有害因素而導致患病，即使找到責任企業(yè)，有的企業(yè)為了逃避責任，不為勞動者如實提供職業(yè)病鑒定所需要的材料，用人單位自證其罪的不能讓勞動者職業(yè)病診斷與鑒定難度增加。二是職業(yè)病具有隱匿性。職業(yè)病是在長期從事有毒有害職業(yè)活動中形成的，具有潛伏時間長的特點，短則幾年，長則達十幾年。以深圳從事爆破工作風鉆工的農民工為例，得在直徑一米二甚至四五米的洞從事爆破工作，鉆機一打開，粉塵四起，就看不到人了。直到10年后，這些風鉆工的身體開始出現(xiàn)病征，但為時己晚，由于大多數(shù)勞動力密集型企業(yè)未建立完善的崗前、離崗健康體檢制度、難以確認的勞動關系和職業(yè)病潛伏時間長等因素，致使大部分勞動者即使得知自己患了塵肺病，也無法獲得及時鑒定，以致影響其最佳救治的時間。

(三)相關職能部門缺乏有力的執(zhí)法取證體系

取證難成為職業(yè)病診斷的攔路虎，職業(yè)病鑒定的流程主要有:申請審核、組織鑒定、出具鑒定書、申請工傷認定、勞動能力鑒定、工傷待遇索賠。一般情況下，走完整個職業(yè)病認定程序需費時1514天。如果用人單位提出對職業(yè)病再次鑒定時，則會大幅度延長職業(yè)病鑒定時間。而審核的關鍵主要是對職業(yè)病申請者材料和勞動關系進行審核，然而對于大多數(shù)職業(yè)病患者來說，最大痛苦并非患了病，而是患了病卻無法得到證明。從程序上來說，要及時治療職業(yè)病，須獲得工傷認定，而要獲得工傷認定，則必須得到職業(yè)病診斷鑒定，然而要獲取各職業(yè)病診斷鑒定，則必須提供職業(yè)史和職業(yè)病危害接觸史。職業(yè)病危害接觸史主要由用人單位掌握，雖然新修改的《職業(yè)病診斷與鑒定管理辦法》第二十八條規(guī)定，經安全生產監(jiān)督管理部門督促，用人單位仍不提供或提供資料不全的，職業(yè)病診斷機構應當結合勞動者的臨床表現(xiàn)、輔助檢查結果和勞動者的職業(yè)史、職業(yè)病危害接觸史，并參考勞動者自述、安全生產監(jiān)督管理部門提供的日常監(jiān)督檢查信息等，作出職業(yè)病診斷結論，但問題在于企業(yè)與地方政府是利益共同體，地方政府僅從當前發(fā)展地方經濟的利益出發(fā)，有可能要求職業(yè)病鑒定機構作出與事實不相符的職業(yè)病鑒定。

二、重構職業(yè)病鑒定制度的路徑

新的《職業(yè)病防治法》實施后，職業(yè)病鑒定在舉證責任方面作出了較大調整，即誰主張誰舉證舉證方式改為舉證責任倒置，但職業(yè)病認定仍過分依賴法定職業(yè)病目錄、繁雜的認定程序等方面仍存在較大的完善空間，因此，在這方面，應借鑒國外的職業(yè)病鑒定經驗以完善不足之處:

(一)擴大勞動者選擇職業(yè)病診斷機構的范圍

一是具有資質的職業(yè)病診斷機構設立過于單一，且數(shù)量偏少。據衛(wèi)生部統(tǒng)計，截止到2011年底，全國市級職業(yè)病診斷機構覆蓋率只達到83 %，仍有個別地級市沒有職業(yè)病診斷機構。從職業(yè)病診斷機構的數(shù)量來說，無法滿足勞動者就近救治的需要，因此，應允許各地三級醫(yī)院申請職業(yè)病診斷機構資質認證，其診斷結果也可作為勞動者職業(yè)病的證明，若有兩份以上不同的職業(yè)病鑒定結果，則交由專家評審委員會根據勞動者患病情況作出最后鑒定，此舉既可改變一家獨斷經營的職業(yè)病鑒定模式，也可以增進勞動者依法維權的信心，從而杜絕類似開胸驗肺這樣的悲劇發(fā)生。

二是職業(yè)病診斷機構難以作出專業(yè)的鑒定。法律將職業(yè)病診斷專有權賦予職業(yè)病診斷機構，其出發(fā)點是希望通過單一機構的專業(yè)化提升職業(yè)病防治水平，但這一設計在一定程度上制約地方政府短期GDP增長，因為若嚴格依法保護勞動者合法權益，必然對企業(yè)的生存造成巨大壓力，因此，地方政府會施加一定的壓力，致使職業(yè)病鑒定機構可能會作出有違公正、專業(yè)的鑒定結果，從張海超塵肺病鑒定事件可以看出，在兩年多的求醫(yī)過程中，張海超在全國各層次的綜合性醫(yī)院做了上百次檢查，其結果均是塵肺病，而在鄭州市職業(yè)病防治所作出的法定結論卻是肺結核，如此截然相反的結果暴露出現(xiàn)行職業(yè)病診斷與鑒定的壟斷，雖然《職業(yè)病防治法》第四十五條規(guī)定，勞動者可以在用人單位所在地、本人戶籍所在地或者經常居住地依法承擔職業(yè)病診斷的醫(yī)療衛(wèi)生機構進行職業(yè)病診斷，雖己對職業(yè)病診斷機構的范圍作了擴大，但職業(yè)病的鑒定除了法定職業(yè)病診斷機構外，其他有職業(yè)病診斷能力的醫(yī)院仍然被排除在外，因此，我國現(xiàn)階段應盡快改革職業(yè)病鑒定體制，建立職業(yè)病專科醫(yī)院或由多家三級醫(yī)療機構組成的混合型職業(yè)病鑒定模式，提升職業(yè)病的診療環(huán)境，凸顯職業(yè)病鑒定制度的公正性、專業(yè)性。

(二)職業(yè)病鑒定制度應重新調校

根據《職業(yè)病防治法》第五十三條的規(guī)定，我國職業(yè)病診斷鑒定實行兩級鑒定體制，即對職業(yè)病診斷結論有爭議的，由設區(qū)的市級以上地方人民政府衛(wèi)生行政部門根據當事人的申請，組織職業(yè)病診斷鑒定委員會進行首次鑒定，不服鑒定結論的，可以向省、自治區(qū)、直轄市人民政府衛(wèi)生行政部門申請再鑒定。從這個意義上講，我國現(xiàn)行職業(yè)病鑒定制度蘊含一裁終局的司法判斷，既然如此，這種侵權責任關系是否成立以及如何進行賠償，都只能由人民法院來判定而不是鑒定機構。以交通事故責任為例，交通警察在交通事故處理方面根據事故現(xiàn)場、證人等有關證據，作出初步的責任劃分認定，但最終責任劃分是否按其執(zhí)行，還要取決于人民法院根據當事人的病情鑒定資料及其他相關工作環(huán)節(jié)的證據作出司法裁決，以認定此人的法律責任和賠償數(shù)額。因此，基于這種法律邏輯關系，職業(yè)病診斷應該校正以行政裁決替代司法審理的錯誤方向。

(三)簡化職業(yè)病認定程序

新《職業(yè)病診斷與鑒定管理辦法》的出臺，最大亮點在于簡化職業(yè)病鑒定申請手續(xù)和在舉證責任方面實行責任倒置，在申請手續(xù)方面，規(guī)定當事人申請職業(yè)病鑒定時，只需提供鑒定申請書和原診斷證明，所需鑒定材料與之前相比大幅度減少，降低當事人申請職業(yè)病鑒定的門檻;在舉證責任方面，勞動者申請職業(yè)病診斷時，由用人單位出具鑒定所需材料，否則，職業(yè)病診斷機構可以根據當事人提供的證據進行診斷。這些變化與之前相比雖有了較大的進步，但職業(yè)病的診斷與鑒定仍依賴法定職業(yè)病目錄，對職業(yè)病界定的范圍過于狹窄，未能充分考慮到勞動者職業(yè)安全的實際。如在巴西，對職業(yè)病的診斷與鑒定并沒有全國統(tǒng)一的職業(yè)病目錄，但凡是重復性勞動損傷或由有毒物質造成的呼吸道疾病等，都可以被認定為職業(yè)病。對于其他疾病，如果企業(yè)有專門醫(yī)生或者合同醫(yī)院，則專門醫(yī)生或合同醫(yī)院的醫(yī)生經檢查后可以出示證明，如果沒有，則由社保部門指定醫(yī)學專家認定。其簡化認定模式大大促進了職業(yè)安全，有利于強化用人單位安全生產的重要性。

(四)降低職業(yè)病診斷門檻

美國的職業(yè)病診斷由四部分組成:一是立法保障方面，美國通過立法把職業(yè)病的診斷和治療納入醫(yī)療保險體系，以減輕職業(yè)病患者康復成本。二是職業(yè)病診斷方面，政府未設專門的職業(yè)病鑒定機構，但依據有關法律，職業(yè)病診斷可由任何普通執(zhí)業(yè)醫(yī)生，甚至家庭醫(yī)生根據自己的專業(yè)知識進行判斷，同時，政府每年出版職業(yè)病識別指南、各種工業(yè)毒物的標準文獻、疾病與工作關聯(lián)指南等指導性文件，幫助有關醫(yī)生更好地進行職業(yè)病認定。三是職業(yè)病爭議解決方面。如果雇主或保險公司拒絕承認醫(yī)生關于雇員職業(yè)病的診斷結果，可由各州政府勞工部門的調解服務處進行調解或仲裁。若雙方仍存在較大爭議或不接受仲裁結果，則可將爭議上訴至法庭，甚至逐級上訴。而最后的審理結果，法院則要在聽取相關醫(yī)療領域知名專家的證詞后作出判決。四是職業(yè)病索賠方面。將職業(yè)病納入工傷范圍是全球通行的規(guī)則，在美國《職業(yè)安全衛(wèi)生法》，不僅在條文上規(guī)定所有雇主都應為每一雇員提供安全保障，更在現(xiàn)實上要求雇主依法為雇員交納工傷保險。由于雇員與雇主之間不存在利益沖突，雇員一旦被診斷為職業(yè)病或發(fā)生工傷后，由保險公司直接賠償，從而縮短了職業(yè)病索賠程序。

(五)推行類職業(yè)病與職業(yè)病并存的職業(yè)病鑒定方式

根據德國法律，凡從事對身體健康權有危害的職業(yè)活動，用人單位就應購買相應的職業(yè)意外事故保險，從而更好地為職業(yè)病的防治提供高效保障，即使如此，仍有些疾病未列入《職業(yè)病條例》或不滿足該條例規(guī)定的條件，被稱為類職業(yè)病，但只要投保的意外事故保險單位認可這一事實，仍可視為患有職業(yè)病，患病投保人就可以享受與此相關的賠償。因此，德國這一做法能在很大程度上為職業(yè)病的預防和最大限度地避免《職業(yè)病條例》不可避免的滯后性，破除類職業(yè)病患者鑒定賠償困境，并盡可能為類職業(yè)病患者提供人性化設計。而在我國，一方面，類職業(yè)病不可能被認為職業(yè)病，更不用說獲得賠償;另一方面，我國職業(yè)病名單與國際勞工組織的職業(yè)病名單相比，仍有較大完善空間，國際勞工組織的職業(yè)病名單(2011年版)分類齊全，既有物理因素所致的疾病，如振動所致的疾病等，也包括職業(yè)性肌肉一骨骼系統(tǒng)疾病，如快節(jié)奏或重復性動作等，全面考慮職業(yè)活動有可能產生危害勞動者身體健康的行為，就連頸椎病這樣大眾化的職業(yè)病也被納入其名單之內。據此，不管是在職業(yè)病名單的覆蓋方面，還是在職業(yè)病認定標準的靈活性方面，我國職業(yè)病鑒定都應借鑒國外經驗，使其變得更加開放和合乎底層勞動者的期盼。

參考文獻:

第3篇：堅定的錫兵范文

的依據。

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；DNA定量檢測；關系

為了探討乙型肝炎病毒 DNA的定量檢測和臨床的關系 ， 本次研究選取 2010年 6月 ～2012年 6月期間來河南省宜陽縣人民醫(yī)院肝病?？凭驮\的 128例患者的臨床資料進行回顧性分析 ， 所選取的患者均通過 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗 ）來檢測乙型肝炎的病毒血清標志物 ， FQ-PCR（熒光定量聚合酶連反應 ）來檢測 HBV-DNA的含量?，F(xiàn)將大致研究結果報告如下。 1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取 2010年 6月至 2012年 6月期間來本院肝病?？凭驮\的128例患者， 其中男73例， 女55例， 年齡在 12～76歲之間 ， 平均 （34.8±14.5）歲 ， 所選取的患者都符合病毒性肝炎的診斷標準。且各類型的肝炎患者之間的資料沒有明顯的差異， 結果具有可比性。

1. 2 檢測的儀器和試劑 HBV血清檢測標志物檢測試劑盒和 HBV核酸擴增熒光檢測試劑盒；熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）分析儀均產自上?？迫A生物技術公司。

1. 3 方法 在患者晨起空腹時抽取 5 ml靜脈血 ， 將血清離心分裝在 -20℃下保存?zhèn)溆?。然后通過 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗 ）來檢測乙型肝炎的病毒血清標志物 ， 操作步驟按照試劑盒的規(guī)定進行。通過 FQ-PCR（熒光定量聚合酶連反應 ）來檢測 HBV-DNA的含量 ， 每一次檢驗都設立強陽性、弱陽性以及陰性作為內標 ， 將四個已經通過的陽性標準品作為外標。在進行檢測時做好室內的質控。

1. 4 觀測的指標 觀測患者血清學的診斷指標和 HBV?DNA的陽性率以及定量檢測的結果情況；血清學的診斷分組：第一組為HBcAb、HBeAg、HBsAg， 第二組為HBcAb、HBeAg、HBsAg， 第三組為HBeAg、HBsAg， 第四組為HBcAb、HBsAg， 第五組為HBeAb、HBcAb、HBsAb， 第六組為HBcAb、HBeAb， 第七組為 HBsAb以及全陰。

1. 5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學處理， 以 P

2 結果

128例患者血清學的診斷指標和 HBV-DNA的陽性率以及定量檢測的結果情況， 詳見表1。

3 討論

近幾年 ，發(fā)展了多種準確的、敏感的、先進的用于 HBV?DNA定量檢測的方法 ， 根據其原理主要有酶標記探針 PCR技術和熒光標記探針的 PCR技術。后者省時 ， 自動化的程度高 ， 而且可以免除 PCR后處理的步驟 ， 減少了 PCR產物對環(huán)境的污染， 現(xiàn)在已經成為了 HBV-DNA定量檢測的主要方法。采用該方法對 HBV-DNA進行定量檢測的范圍為 3～8， 如果檢測的值比最低的檢測水平 -3低 ， 將結果判斷為陰性。在進行數(shù)據統(tǒng)計時 ， 將陰性的結果忽略不計或者計算為 0， 而求得 HBV-DNA對數(shù)的平均值的計算結果 ， 這種方法是不合理的。如果要合理的反映不同類型的乙型肝炎病毒患者體內的HBV-DNA的含量 ， 應該采用中位數(shù)的差異 H來進行 HBV?DNA的含量比較。

我國現(xiàn)在屬于乙型肝炎大國 ， 發(fā)病率在全世界排在前幾位。有研究表明 ， HBsAg的流行率大約為 9.75%， 當人體感染了乙型肝炎病毒之后會出現(xiàn)不同的癥狀以及臨床表現(xiàn)。HBeAg呈陽性表示患者體內的乙型肝炎病毒在活躍的復制 ， 表明其具有很強的傳染性[2]。HBcAb、HBeAg、HBsAg的HBV-DNA的陽性率為 98.6%， ， HBeAg、HBsAg為 100%， 說明本組患者的 HBeAg陽性血清指標的模式組主要為第一組和第三組 ， 而且其 HBV-DNA的陽性率以及 HBV-DNA的定量都比其他各組要高， 說明 HBeAg有可能與 HBV-DNA的含量之間存在一定的正相關性[3]。HBcAb、HBeAg、HBsAg為

25.2%， HBV-DNA 的對數(shù)的平均值為 （5.03±1.86）， HBcAb、HBsAg為20%， HBV-DNA 的對數(shù)的平均值為（6.28±0.48）， 說明當 e系統(tǒng)的抗原陰轉時 ， HBV-DNA還是有可能被檢測到 ， 雖然其含量比第一組和第三組低。HBeAb、HBcAb、HBsAb為 14.5%， HBV-DNA 的對數(shù)的平均值為 （3.54±0.45）， 說明HBsAb是一種保護性的抗體。

綜上所述 ， 各種類型的乙型肝炎患者都有一定程度HBV-DNA復制 ， HBeAg的陽性患者其 HBV-DNA的水平最高 ， 將 HBV-DNA和 HBeAg定量聯(lián)合進行診斷 ， 可以為早期的乙型肝炎篩查以及治療提供可靠的依據。

參考文獻

[1]李金明 . 乙型肝炎病毒血清標志物測定及結果解釋的若干問題 .中華檢驗醫(yī)學雜志 ， 2006，29（5）：385.

第4篇：堅定的錫兵范文

目前，生產上對黃瓜白粉病的防治以化學藥劑（唑類殺菌劑）為主，但隨著化學藥劑的長期大量使用，白粉病菌對化學藥劑的抗性逐年增強1，并且化學藥劑在瓜條內的農藥殘留直接威脅著人類健康。國內外相關研究表明生防微生物對黃瓜白粉病菌也具有較好的抑制作用，但相關研究正處于實驗室研究階段。本研究旨在從土壤中分離篩選出對黃瓜白粉病具有明顯防效的生防菌株，為黃瓜白粉病的安全防治提供優(yōu)良的生物資源，服務于農業(yè)生產。 

1材料與方法 

1.1材料 

土樣：采自天津西青、靜海、武清黃瓜溫室根際土壤，共28份。 

病原菌：黃瓜白粉病菌（Erysiphe cucurbitacearum）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）。 

1.2拮抗細菌的分離與室內篩選 

土壤細菌的分離：稱量土壤樣品10 g，加入到裝有100 mL水的三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)（160 r/min）30 min。將土壤懸浮液系列稀釋至10-1～10-6，取稀釋濃度為10-4和10-5各100 μL涂至LB平板上，37℃培養(yǎng)24 h。 挑取不同形狀的單菌落于LB斜面上，37℃培養(yǎng)24 h后4℃冰箱保存。 

拮抗細菌的室內篩選：采用平板對峙培養(yǎng)法測定分離出的細菌菌株對黃瓜灰霉病菌的抑制作用。待對照長滿平皿時測量菌落生長直徑，計算菌株的拮抗率。將拮抗率60%以上的菌株保存于20%甘油的凍存管中。 

1.3溫室盆栽防治試驗 

拮抗細菌發(fā)酵液的制備：將拮抗性良好的菌株轉接在LB平板上活化24 h后接種至LB液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)48 h（28℃，160 r/min），制成菌體含量為108 cfu/mL的菌體發(fā)酵液原液。 

盆栽防治試驗：營養(yǎng)缽中播種黃瓜（品種為津優(yōu)3號），黃瓜白粉病發(fā)病初期將拮抗細菌發(fā)酵原液2倍稀釋液均勻噴灑在黃瓜葉片上，間隔1周后噴施第二次。每處理10株幼苗，重復3次，以噴灑清水處理為對照。第二次噴藥1周后分級調查黃瓜白粉病的發(fā)病情況2，計算拮抗細菌的防治效果。 

1.4拮抗菌株鑒定 

1.4.1形態(tài)鑒定觀察菌落的形態(tài)、顏色、邊緣、透明度、凹凸度等，革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。 

1.4.2生理生化鑒定細菌的生理生化特性（革蘭氏染色、芽孢染色、檸檬酸鹽的利用等）分析參照植物病原細菌鑒定試驗指導（第三版）3～6。 

1.4.316s rDNA分子鑒定采用Lysis方法提取防效好的菌株基因組DNA，以原核生物16S rDNA保守序列通用引物進行PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）為：模板DNA 1 μL，Taq Buffer 25 μL，引物P0和P1各1 μL，用雙蒸水補足至50 μL。PCR反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產物經測序后，通過Blast程序對該序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列進行同源性比較。 

2結果與分析 

2.1拮抗細菌的分離與篩選 

第5篇：堅定的錫兵范文

關鍵詞：南酸棗；內生細菌；芒果炭疽病菌；防治效果

中圖分類號：Q939.95文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2398-03

Identification of Choerospondias axillaris Endophytic Bacterial Strain WYG5 and Its Effects on Preservating Postharvest Mango

WU Jia-fei，LI Xiao-yu，F(xiàn)AN Yong-mei，LIU Zhi-qiang

（College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Abstract：Strain WYG4，isolated from Choerospondias axi11aris（Roxb1） Burttet Hill，had higher antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides， with antagonistic activity of 32% in plate. According to its morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the strain WYG5 was identified as Bacillus megaterium. Its fermentation broth and fermentation filtrate had obvious effects on preservating postharvest mango. After 9 d and 12 d treatment，the controlling effects were up to 60.76%， 59.50% and 43.59%，34.19%， respectively.

Key words：Choerospondias axillaris； endophytic bacteria； Colletotrichum gloeosporioides； control effect

基金項目：國家自然科學基金項目（31160377）；國家科技支撐計劃項目（2012BAK01B05）

南酸棗（Choerospondias axillaris）為漆樹科南酸棗屬落葉大喬木，多年生，又名五眼果、酸棗樹、山棗子等，主要分布于云南、廣東、廣西、湖南、湖北、江西、福建、浙江、貴州等地區(qū)[1]，其樹皮和果實可以入藥，樹皮主治瘡瘍、湯火傷、陰囊濕疹；鮮果則消食滯，治食滯腹痛；果核醒酒解毒，治風毒起疙瘩成瘡或瘍癰[2]。

植物內生菌是指在其生活史的一定階段生活在活體植物組織內，而不引起植物明顯病害的微生物[3]。許多研究表明植物中的內生細菌對宿主具有抗病促生的能力，作為生物菌劑在生物防治方面和促進植物生長方面有著重要的應用價值[4，5]。試驗從南酸棗體內分離出一株內生細菌WYG5，發(fā)現(xiàn)其對芒果炭疽病菌具有較好的拮抗效果，利用常規(guī)方法結合16S rDNA序列分析對該菌株進行了鑒定，并測定了其對采后芒果的保鮮防病效果，為其今后應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料南酸棗采自海南大學儋州校區(qū)，內生細菌WYG5從南酸棗中經組織表面消毒分離獲得。芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）由海南大學環(huán)境與植物保護學院提供，芒果品種為臺農l號。

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，去離子水1 L。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)菌株WYG5經活化后接入LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d，收集發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，將上清液利用0.22 μm的濾膜除菌過濾，得到發(fā)酵濾液。

1.2.2 菌株WYG5的鑒定采用常規(guī)鑒定方法進行[6]。菌株基因組DNA利用Bacterial DNA Kit（50）試劑盒提取，利用16S rDNA通用引物（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行基因擴增，由上海英駿生物技術有限公司進行序列測定，將所測序列在GenBank中進行Blast分析，根據Blast結果利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3菌株WYG5皿內拮抗活性測定 在直徑9 cm的PDA平板中央接種1塊直徑為5 mm芒果炭疽病菌的菌餅，菌絲面朝下，同時在菌餅兩側2 cm處各接入一環(huán)內生細菌WYG5，以不接內生細菌為對照，每處理3次重復，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，十字交叉法計算皿內拮抗活性。

1.2.4菌株WYG5對芒果的防病效果取健康無病、大小均一、約八成熟芒果果實，用75%酒精表面消毒后，自然晾干備用。處理液包括發(fā)酵液、10倍稀釋發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、10倍稀釋發(fā)酵濾液，以去離子水處理為對照。處理時將果實分別于各處理液中浸泡10 min，晾干后裝入保鮮盒中放置，在處理后第6、9、12 天共調查3次，逐次記錄并累加炭疽病病果數(shù)和病級，計算病指和防效，并對防效進行方差分析。具體方法參照國家標準GB/T 17980.98-2004進行。

果實發(fā)病程度分級方法如下，0 級：無?。? 級：病斑面積占果實面積的5%以下；3 級：病斑面積占果實面積的 6%～15%；5 級：病斑面積占果實面積的 16%～25%；7 級：病斑面積占果實面積的 26%～50%；9 級：病斑面積占果實面積的 50%以上。試驗數(shù)據采用DPS處理，進行差異顯著性分析。

病情指數(shù)= [∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)）/（調查總果數(shù)×9）]×100

防效=[（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

2結果與分析

2.1菌株WYG5的鑒定

菌株WYG5在培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淺黃色，邊緣整齊，表面有凸狀隆起，干燥，不透明，革蘭氏染色陽性，芽孢染色陽性，菌體桿狀，周生鞭毛。菌株WYG5 的形態(tài)和生理生化特征與東秀珠等[6]描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）特征相同。對菌株WYG5的16S rDNA序列進行PCR擴增，產物經純化后測序，得到 1 515 bp的堿基序列。將16S rDNA 序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它與多株巨大芽孢桿菌菌株的同源性均在99%以上。選取GenBank中的8株芽孢桿菌屬的細菌與菌株WYG5一起，利用軟件MEGA 5.0構建出基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可以看出，菌株WYG5與巨大芽孢桿菌的同源性最高，結合形態(tài)觀察和生理生化特征分析，確定菌株WYG5為巨大芽孢桿菌。

2.2菌株WYG5皿內拮抗活性的測定

采用十字交叉法測定菌株WYG5對芒果炭疽病菌的皿內拮抗活性，結果表明，該內生細菌對芒果炭疽病菌有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中的擴展，抑制率達到32%。

2.3菌株WYG5對芒果的防病效果

內生細菌WYG5的不同處理液對采后芒果的保鮮防病效果見表1。6 d相對于芒果保鮮來說時間較短，6 d時對照組病情指數(shù)僅為7.04，處理防效雖高但意義不大，故重點討論了9 d和12 d的防效。其中菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理9 d時的防效分別為60.76%和59.50%，不存在顯著差異；12 d時的防效分別為43.59%和34.19%，存在極顯著差異，發(fā)酵液的保鮮防病效果明顯優(yōu)于發(fā)酵濾液。稀釋10倍發(fā)酵液處理9 d時的防效為54.43%，與發(fā)酵液處理不存在顯著差異，而處理12 d時兩處理防效差異極顯著。稀釋10倍發(fā)酵濾液處理9 d和12 d時的防效均極顯著低于發(fā)酵濾液的防效。

3結論與討論

巨大芽孢桿菌作為植物內生細菌已有報道，如農倩等[7]從水稻體內分離到一株巨大芽孢桿菌B196，對水稻紋枯病菌的生長具有較強的抑制作用，盆栽和田間防效分別為64.29%和55.13%；林天興等[8]從苦豆子中分離出48株對棉花枯萎病菌和黃萎病菌有較強拮抗作用的內生細菌，并對其遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；張鑫等[9]從無紋紫背苔葉片中分離出一株內生菌z12，鑒定為巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻紋枯病菌均有較強的抑制作用；林娜等[10]從山蒼子的根、莖、葉和果中分離出內生細菌52株，其中一株對辣椒疫霉病的防治效果較好，且可促進辣椒植株生長。試驗從南酸棗中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析，鑒定將該菌株為巨大芽孢桿菌，經測定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對采后芒果均有明顯的保鮮防病效果，處理9 d后防效分別為 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%，有關該菌的抗病機理及抑菌活性物質還有待進一步研究。

參考文獻：

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[4] 盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君.植物內生細菌的分離、分類、定殖與應用[J].生命科學，2006，18（1）： 90-94.

[5] 張穎，王剛，郭建偉，等.利用小麥內生細菌防治小麥全蝕病的初步研究[J].植物病理學報，2007，37（1）： 105-108.

[6] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京： 科學出版社，2001.

[7] 農倩，陳雪鳳，黎起秦，等.水稻內生細菌B196的鑒定及其對水稻紋枯病的防治作用[J].中國生物防治學報，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天興，李超，龔明福.拮抗性苦豆子內生細菌的遺傳多樣性[J].安徽農業(yè)科學，2011，39（24）： 14673-14675.

第6篇：堅定的錫兵范文

論文關鍵詞：香蕉枯萎病菌,號小種,拮抗細菌,基因,鑒定

關鍵詞：香蕉枯萎病菌；拮抗菌；16SrRNA基因；鑒定

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usariumoxysporumfsp.cubense）侵染而引起香蕉維管束壞死的一種真菌病害。目前在香蕉枯萎病的防治方面，缺乏有效的化學防治試劑，農業(yè)防治措施也不能達到較理想的效果。因此，生物防治作為一種經濟、安全、有效的防治措施成為了研究的熱點。目前，對于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中于香蕉枯萎病拮抗菌的篩選及其室內盆栽防治試驗。Thangavelu等報道獲得對香蕉枯萎病的防治效果為48%~51%的哈茲木霉(Trichodermaharzianum)，獲得防治效果為41%熒光假單孢桿菌（Pseudomonasfluorescens）能誘導植物產生系統(tǒng)抗性抑制香蕉枯萎病，枯草芽孢桿菌也有較好的防效。曹理想等報道，在研究香蕉內生菌區(qū)系時，發(fā)現(xiàn)幾株玫瑰淺灰鏈霉菌(Streptomycesroseogriseolus)對香蕉枯萎病菌有一定拮抗作用。本試驗旨

資助項目：廣東省農業(yè)廳(粵農函2006-229)

*通訊作者.Authorforcorrespondence,E-mail:chunpingyou@sina.com

在從香蕉根際土壤中篩選出對香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生物防治細菌菌株，并對其拮抗作用和分類地位進行研究，為香蕉枯萎病生物制劑的開發(fā)打下基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株香蕉枯萎病菌4號小種(Fusariumoxysporumf.sp.Cubenserace4)由仲愷農業(yè)工程學院植物病理實驗室提供。

1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB配方參考方中達的方法。

1.2方法

1.2.1土壤細菌的分離從不同果園的香蕉植株根際取得土壤樣本，將1g根際土置于滅菌的小三角瓶內，加入9ml無菌水稀釋，搖勻成懸浮液，用接菌環(huán)蘸取一環(huán)于NA培養(yǎng)基上劃線分離。28℃下培養(yǎng)2d，在培養(yǎng)基上挑取不同形態(tài)的單菌落，進一步分離純化后，挑取不同形態(tài)的單菌落進行保存。

1.2.2拮抗細菌的初步篩選保存的細菌單菌落分別接入裝有20mlNB培養(yǎng)液的小三角瓶中，于28℃振蕩培養(yǎng)24h。拮抗菌的篩選采用對峙培養(yǎng)法，先將香蕉枯萎病菌菌絲塊接于平板的一側，再在平板另一側（與病菌菌絲塊相距3cm）放上浸透細菌菌液的滅菌濾紙片，于28℃培養(yǎng)4d后，觀察細菌對枯萎病菌的抑制效果，初步篩選出對香蕉枯萎病菌有抑制效果的拮抗細菌。

1.2.3拮抗細菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用拮抗細菌與香蕉枯萎病菌采用對峙培養(yǎng)的方法，在PDA平板一側接入于PDA培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng)5d的香蕉枯萎病菌菌絲塊（Φ5mm），在相距菌絲塊邊緣3cm處用打孔器打一直徑為5mm的孔，吸取細菌培養(yǎng)液25μl注入孔中，以注入B培養(yǎng)液為對照，每處理4次重復。于28℃培養(yǎng)5d后，觀察細菌是否具有拮抗效果，并測量其抑菌圈直徑。

1.2.4拮抗細菌對香蕉枯萎病菌菌絲的作用方式拮抗細菌與香蕉枯萎病菌作平板對峙實驗后，如果拮抗菌對枯萎病菌產生抑制效果，在抑菌圈的交界處切取菌絲塊，在顯微鏡下進行觀察，研究拮抗細菌對香蕉枯萎病菌的作用方式。以病菌菌落邊緣的正常菌絲做為對照。

1.2.5拮抗細菌發(fā)酵液對香蕉枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用實驗方法參考肖愛萍等方法，12h后觀察孢子萌發(fā)率，根據下列公式計算孢子萌發(fā)抑制率：

孢子萌發(fā)抑制率（%）=

對照平均孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率

第7篇：堅定的錫兵范文

【關鍵詞】高脂血癥；載脂蛋白；動脈粥樣硬化指數(shù)

載脂蛋白（apo）是脂蛋白（Lp）顆粒外層的蛋白質部分，是脂蛋白組成中的關鍵物質，已經闡明各種載脂蛋白與脂代謝的關系非常密切，其主要功能是維持脂蛋白結構與脂類運輸，調控脂代謝存在酶的活力，以及作為細胞表面Lp受體的配體，而參與脂蛋白代謝，從人和動物血漿和淋巴液中分離的多種apo中明確存在于人血漿中的有APOA-Ⅰ、AⅡ、AⅣ、B-100、B-48。CⅠ、CⅡ、CⅢ、D（即AⅢ）、E、F、G及apo（a）等用于動脈粥樣硬化（AS）風險度估計的指標是APOA-Ⅰ、APOB-100[1]。

APOA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白質，它的血清濃度代表HDL水平，正常情況下APOB占低密度脂蛋白（LDL）中蛋白質的97%及低密度脂蛋白（VLDL）中蛋白質的37%左右，所以APOB水平主要反應LDL水平，但VLDL多時，APOB也會有所增高，通常認為HDL是動脈粥樣硬化的防御因素，而LDL是致病因素，所以血清APOA-Ⅰ減少及APOB升高，提示動脈粥樣硬化發(fā)生的危險性增加，APOA-Ⅰ/APOB-100比值，被稱為動脈粥樣硬化指數(shù)[2]。

1標本來源與方法

住院患者空腹靜脈血，同時用生化分析儀做膽固醇、甘油三脂、其中一項或兩項均高者，再用聯(lián)合免疫電泳去測其血清中APOA-1，與APOB-100的含量。

3討論

從表1可以看出，隨著年齡的增加，其APOA-Ⅰ的水平在下降，APOB-100的水平相對增高，膽固醇的含量也隨著年齡的增加而增高，A/B比值，隨著年齡的增加而減少，甘油三脂的含量隨著年齡的增加而增高，通過P值可以看出，各年齡組的測定結果有顯著性差異。

從表2可以看出，高血脂病人當中63.3%患者血清APOA-Ⅰ與APOB-100的含量仍維持在正常水平。

其二者的比值也在正常水平，其平均比值為1.5。說明高血脂人群中，有少數(shù)人載脂蛋白含量未發(fā)生改變，而大多數(shù)病人已發(fā)生改變，根據有關資料報道，A/B的正常參考值為1.3±0.56比值小于1.3就預示著疾病的存在，比值越小，疾病嚴重程度越深。

從表3可以看到高血脂病人當中，48.9%患者血清APOA-Ⅰ的含量仍維持在正常水平，其A/B的平均比值為1.36，51.1%的患者血清APOA-Ⅰ的含量下降，其A/B的平均值為0.9。

從表4可以看到高血脂病人當中，88.9%患者血清APOB-100的含量明顯增高，其A/B的平均比值為1.11，而11.1%的患者血清APOB-100仍維持在正常水平，其A/B的平均比值為1.35。

綜上所述，用聯(lián)合免疫電泳測人血清APOA-Ⅰ，APOB-100方法簡易，準確性高，在冠心病危險的預測上APOB的測定，可能比總膽固醇測定更好、更有意義。

參考文獻

[1]李健齋.血清載脂蛋白免疫測定及其標準化問題.中華醫(yī)學檢驗雜志，1992，15（1）：47.

[2]吳希云.載脂蛋白A1和載脂蛋白B的測定在肝病中的意義.全國肝病實驗室診斷論文匯編，74-75.

第8篇：堅定的錫兵范文

【摘要】 目的： 構建攜帶人白細胞介素10(hIL10)和人肝細胞生長因子(hHGF)雙基因的重組腺病毒載體。方法： 分別以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF重組質粒為模板，PCR擴增獲得hIL10和hHGF基因片段，與pIRES連接成為hIL10IREShHGF，測序正確后酶切，與pDC315連接，獲得穿梭質粒pDC315hIL10IREShHGF，與腺病毒包裝系統(tǒng)轉染293細胞，包裝產生重組腺病毒hIL10hHGF，PCR鑒定后，擴增病毒，并測定病毒滴度。用重組腺病毒轉染BEL7402和WRL68細胞，ELISA法檢測上清液中hIL10和hHGF的含量。結果： 成功構建了重組腺病毒hIL10hHGF，擴增純化后測得重組腺病毒滴度為1×109 pfu/ml，轉染BEL7402和WRL68細胞72 h后，表達hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表達hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml。結論： 本實驗為進一步研究AdhIL10hHGF在動物體內抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎。

【關鍵詞】 白細胞介素10; 肝細胞生長因子; 腺病毒載體

[Abstract] Objective: To construct the recombinant adenovirus vector carrying human interlerkin10(hIL10) and human hepatocyte growth factor(hHGF).Methods： We amplified hIL10 and hHGF genes by PCR with plasmids pDC316hIL10EGFP and pCDNA3hHGF， respectively， and subcloned into pIRES to generate hIL10IREShHGF. Confirmed by sequence analysis， the hIL10IREShHGF genes were inserted into the vector pDC315， then the shuttle plasmid pDC315hIL10IREShHGF was constructed， which was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid into 293 cells to obtain the recombinant adenovirus vector hIL10hHGF. After identified the target genes by PCR， the recombinant adenovirus was propagated and the viral titer was determined. hIL10 and hHGF proteins in the virusinfected BEL7402 and WRL68 cells were measured by ELISA. Results： We obtained recombinant adenovirus vector of hIL10hHGF successfully. After propagation， the titer of the recombinant adenovirus was 1×109 pfu/ml. The recombinant adenovirus could express hIL10 and hHGF in BEL7402 and WRL68 cells effectively. The concentrations of hIL10 were(6 271.7±5.2) pg/ml and(350.6±12.4) pg/ml respectively， and the concentrations of hHGF were(20 827.1±345.5) pg/ml and(201.6±10.1) pg/ml respectively. Conclusion： The recombinant adenovirus vector hIL10hHGF seted the foundation for the gene therapy of hepatitis and cirrhosis in animals.

[Key words] interlukin10; heptocyte growth factor; adenovirus vector 肝炎、肝炎后肝硬化嚴重危害人類健康，通過基因治療手段來預防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。IL10是一個多效性細胞因子， 具有廣泛的生物學作用。研究表明內源性IL10 對肝細胞具有保護作用，而且給予外源性IL10 也顯示了明顯的抗肝細胞損傷作用[1，2]。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor， HGF)被認為是最強的肝再生促進劑，是一種具有多功能的生物大分子，它有強效的抗肝炎、促肝再生作用[3，4]。本研究擬構建人IL10和HGF雙表達的重組腺病毒hIL10-HGF，為腺病毒介導IL10及HGF基因治療肝炎、預防肝損傷建立實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質粒和菌株 含HGF基因的質粒pCDNA3HGF由江蘇省人民醫(yī)院血液科惠贈，含hIL10基因的質粒pDC316EGFPhIL10，pIRES，pDC315，pDC312，大腸埃希菌菌株Top10、腺病毒骨架質粒、腺病毒包裝細胞HEK293細胞和肝癌BEL7402、正常肝臟WRL68細胞均由南京師范大學生命科學學院細胞生物學實驗室惠贈。

1.1.2 酶類和主要試劑 限制性內切酶、T4連接酶、Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA，DNA 標準參照物、蛋白酶K購自Takara公司;DMEM購自Gibco BRL公司;DMSO為Amresco公司產品;胎牛血清購自杭州四季清公司，56℃滅活30 min;轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;0.22 μm無菌濾器及濾膜購自Millipore公司;膠回收純化試劑盒及質粒提取試劑盒購自AXYGEN公司，引物由上海生工公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 PCR法擴增目的基因 以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF為模板，hIL10上下游引物5′端分別引入NheI和EcoRI的位點，上游引物P1：5′CGGCTAGCACCATGCACAGCTCAGCACTGC3′;下游引物P2：5′GAGAATTCTCAGTTTCGTATCTTC3′;HGF上下游引物5′端分別引入XbaⅠ和SalⅠ酶切位點，P3：5′GCTCTAGAACCATGTGGGTGACCAAACTC3′;下游引物P4：5′GAGTCGACCTATGACTGTGGTAC 3′; 94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃連續(xù)延伸7 min。擴增完畢后進行膠回收獲得目的片段。

1.2.2 測序質粒的構建與鑒定 NheⅠ，EcoRⅠ和XbaⅠ，SalⅠ分別酶切pIRES及目的片段，割膠回收純化，用T4 DNA連接酶與hIL10，hHGF連接，片段∶載體=3∶1(摩爾比)。將連接產物轉化Top10感受態(tài)，涂布于含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃，220 r/min恒溫搖床振搖16 h。抽提質粒，30 μl ddH2O溶解。取10 μl抽提質粒和載體pDC312分別用NheⅠ，SalⅠ酶切，產物電泳，割膠回收hIL10IREShHGF片段和線性化載體pDC312，T4 DNA連接酶連接，轉化，抽提質粒，酶切鑒定。取鑒定陽性的質粒1～2 μl送上海生工公司測序，測序正確的質粒命名為pDC312hIL10IREShHGF。

1.2.3 重組穿梭質粒的構建與鑒定 NheⅠ、SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收產物，30 μl ddH2O溶解，T4 DNA連接酶連接，轉化Top10感受態(tài)，與含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板篩選，挑取20個最小克隆接種至2 ml LBAmp+(50 μg/ml)液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min恒溫搖床振搖過夜，取菌液進行菌液電泳，選出可疑陽性的菌株進行PCR鑒定，確定含2 200 bp和540 bp條帶后，選兩個陽性菌株進行大量擴增，采用堿裂解法抽提質粒，獲得pDC315hIL10IREShHGF。

1.2.4 腺病毒的包裝、鑒定及擴增 2 μg質粒和2 μg腺病毒骨架質粒共轉染HEK293細胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)5～7 d，細胞病變，-80℃、37℃水浴凍融5次收集病毒，再次感染HEK293細胞，最終收集的PBS重懸病毒上清，PCR鑒定，分別以含目的基因的重組穿梭質粒、重組腺病毒及不含目的基因的重組腺病毒為模板進行擴增，反應條件同“1.2.1”，鑒定后-80℃分裝保存。重組腺病毒命名為AdhIL10hHGF。

1.2.5 TCID50法滴定重組腺病毒效價 10%的培養(yǎng)液調整HEK293細胞為1×105個/ml，接種至96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h;分別加入10-1～10-12濃度的病毒，留最后兩孔加入無血清培養(yǎng)基作為對照孔，每組設8孔，培養(yǎng)10 d，每天觀察細胞病變效應情況。

1.2.6 重組腺病毒載體在BEL7402和WRL68中的表達 取BEL7402和WRL68細胞傳于6孔板，貼壁后24 h吸棄培養(yǎng)液，滅菌PBS(1×)洗2～3遍，加入MOI=20的AdhIL10hHGF轉染液，45 min搖勻1次，90 min后棄去轉染液，加入含5%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察細胞有無變圓和蝕斑現(xiàn)象，ELISA檢測上清液中hIL10和hHGF的含量。

2 結 果

2.1 目的片段PCR擴增結果

以pDC316EGFPhIL10和pCDNA3hHGF為模板，PCR擴增出預期片段，約540 bp的hIL10基因片段和2 200 bp的hHGF基因片段(圖1)。

2.2 pIREShIL10hHGF和 pDC312hIL10IREShHGF的酶切鑒定結果

用NheⅠ，SalⅠ酶切pIREShIL10hHGF產生3 400 bp和5 400 bp的兩個片段(圖2a)，用XbaⅠ，SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF產生2 200 bp的hHGF和4 540 bp的兩個片段(圖2b)，證明為預期質粒，可用于后續(xù)實驗。

2.3 pDC315hIL10IREShHGF的篩選、鑒定及擴增結果

pDC312hIL10IREShHGF質粒用NheⅠ和SalⅠ雙酶切，釋放3 400 bp大小的片段，與用NheⅠ和SalⅠ雙酶切的pDC315連接得到pDC315hIL10IREShHGF，進行PCR鑒定，證實所得質粒正確(圖3a-d)。

(a)菌液電泳篩選，M: DL15000標準參照物，1：pDC315質粒，2、3、5、7為可能陽性質粒pDC315hIL10IREShHGF; (b)菌液PCR篩選pDC315hIL10IREShHGF，M: DL15000 標準參照物，1:陰性對照，2: pDC316EGFPhIL10質粒陽性對照，6，10為hIL10陽性;(c)第6，10號菌液PCR鑒定，M: DL15000標準參照物，1: pCDNA3hHGF質粒陽性對照;(d)大提質粒pDC315hIL10IREShHGF鑒定，M: DL15000標準參照物，1: pDC315質粒，2-4: 質粒pDC315hIL10IREShHGF

圖3 pDC315hIL10IREShHGF鑒定

Fig 3 Identification of pasmid pDC315hIL10IREShHGF

2.4 病毒滴度測定結果

重組腺病毒質粒轉染HEK293細胞4～10 d可見細胞病理效應，細胞形態(tài)變圓，細胞核增大，細胞貼壁性降低，有死亡漂浮的細胞等。擴增病毒的滴度為1×109 pfu/ml。

2.5 AdhIL10hHGF的PCR鑒定結果

AdhIL10hHGF經PCR鑒定，擴增出2 200 bp的hHGF 和540 bp的hIL10條帶，證實所得病毒正確(圖4)。

M1: 10000 標準參照物，1，2: hHGF陽性，3，4: hIL10陽性，M2: DL2000 標準參照物

圖4 腺病毒擴增后PCR鑒定

Fig 4 PCR identification of AdhIL10hHGF

2.6 AdhIL10hHGF在BEL7402和WRL68中的表達

BEL7402和WRL68細胞感染AdhIL10hHGF 72 h后，ELISA檢測上清液中hIL10和hHGF的含量，結果表達hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表達hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml 。

3 討 論

肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌嚴重危害人類健康，盡管經過數(shù)十年，幾代科學家的共同努力，對這些疾病的診斷及治療已取得了重要進展，但對絕大多數(shù)晚期病例尚缺乏有效治療手段。通過基因治療手段來預防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。

肝細胞生長因子在肝臟中主要由非實質性細胞如肝星狀細胞和血竇內皮細胞分泌，Kupffer細胞也少量分泌，實驗表明[5]，HGF是肝細胞生長和DNA合成最強大的刺激劑， HGF通過旁分泌和自分泌機制啟動肝臟再生，刺激肝細胞的生長。在肝纖維化的過程中，HGF起到了抑制肝纖維化的作用，還可用來治療急慢性腎功能不全、肺炎、肺纖維化、外傷、胃潰瘍以及循環(huán)系統(tǒng)等疾病。HGF的這種廣泛而有效的藥理治療作用，促使眾多的醫(yī)藥研究者們投入到HGF的開發(fā)研究中。用HGF治療疾病也可采取蛋白制劑給藥，但因HGF半衰期較短，因而需要大量反復應用才能維持局部較高的藥物濃度，有時即使重復應用也難達到有效的濃度，因此應用蛋白制劑費用較高，故近年來興起基因治療的方法。

人IL10 主要由單核細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞分泌，現(xiàn)已證實Th1和Th2細胞受刺激后均可分泌IL10，肝內kupffer細胞也可分泌，而且是肝內IL10 的主要來源[6]。IL10具有維持機體免疫反應穩(wěn)定，抑制病原體引起對機體有害炎癥反應的功能。IL10在控制局部炎癥特性上對肝臟起保護作用，并通過抑制炎癥介質的釋放、核因子κB活性等途徑阻止肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此IL10具有潛在的強大抗肝纖維化作用，有望成為抗肝纖維化基因治療新的有效目的基因。

腺病毒載體是目前發(fā)展得較快的載體系統(tǒng)，它以遺傳毒性低、致病性小、宿主范圍廣、滴度高、感染效率高和裝載容量大等優(yōu)勢已廣泛用于基因治療，也為體內外轉染肝細胞進行基因治療提供了有力的保證[8]。保護肝細胞的基因治療目的基因既要能快速表達，又不必長時間持續(xù)地表達，這也正是我們構建攜帶人IL10基因和HGF基因的腺病毒載體進行體內轉染肝細胞研究的重要出發(fā)點之一。

本實驗通過PCR鑒定、限制性酶切分析及序列測定，均證明已正確構建重組穿梭質粒pDC315hIL10IREShHGF，并在HEK293細胞中與腺病毒骨架質粒同源重組，成功包裝重組腺病毒hIL10hHGF。本研究所構建的AdhIL10hHGF能在體外感染肝臟細胞和肝癌細胞，并成功表達出hIL10和hHGF，為進一步研究AdhIL10hHGF在動物體內抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎。

參考文獻

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[3] Lindroos PM， Zarnegar R， Michalopoulos GK， et al. Hepatocyte growth factor rapidly increases in plasma before DNA synthesis and liver regeneration stimulated by partial hepatectomy and carbon tetrachloride administration[J]. Hepatology， 1991，13(4):743-750.

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第9篇：堅定的錫兵范文

端 希 朋 從 竹

2、讀拼音，寫漢字。（24分

bì 　fēnɡ　 yǐnɡ lánɡ 水　秀 倒 　畫

yā ōu 　 　 dù 　 　 yàn

烏 海 鵑 大

yǒnɡ yǒnɡ qí 　qí 遠　敢　好　下

chì chì cónɡ 　 cónɡ

腳膀　花　順

zhuān xīn 　zhì zhì tiān chánɡ rì jiǔ

3、寫出帶有下列偏旁的字。（4分） 4、填上合適的詞語（6分）

一（ 把 ）雨傘 （ 歡樂 ）的潑水節(jié) （ 飛快 ）地前進

一（ ）黑板 （ ）的蝴蝶谷 （ ）地爬行

一（ ）針 （ ）的鳥窩 （ ）地計算

5、照樣子寫詞語。（6分） （1）黑乎乎綠油油　 　 　 　 　 （ 2 ）馬馬虎虎 平平安安 　 　 　 　 6、選詞填空。（8分）

傳揚　表揚（1）老師常常（）學習有進步的同學。

（2）勝利的消息很快在村子里（　）開來。

激動　感動（3）仙人被沉香的孝心（?。┝?，送他一把神斧。沉香拿著神斧，想到就要劈開華山，見到媽媽，心里很（?。?/p>

黃黃的　藍藍的　尖尖的　茂密的（4）星期天，我坐在陽臺上畫畫，我先在紙上畫了一片（　）森林。又在森林的上方畫了（?。?/p>

天空和幾朵白云，然后，我在森林中畫了幾只小鳥，（?。┯鹈?，（　）小嘴，可愛極了。最后，我給 畫兒起了一個名字：小鳥的家。

二、按課文內容完成練習。（23分）

1．把詞語補充完整(6分)

來 往 烘 托 活 虎

習 武 五 顏 中 外

2．按課文內容填空。（17分）

① 節(jié)，家家 。我一邊吃 　 　 ，一邊聽爺爺講有關月

亮的故事。春節(jié)到了,我們一起吃 ,去 年。（5分）

②我想變 　的星星，我想變　 的新月。最后，我看見小

小的 　，真想變成大大的 。（4分）

③ 好雨知時節(jié)，當春乃發(fā)生。 ， 。（4分）

④ 通過學課文，我們讀懂了許多有趣的故事：《狐假虎威》說的是：狡猾的

借著老虎的 ，把百獸嚇跑了?！逗诎迮芰恕分v的是物理學家

的故事。他搞科學研究非常 。（4分）

三、課外閱讀（12分）1.安徒生是（ ）國的童話作家，世界文學童話創(chuàng)始人，被世人公認是 “童話”。A.中國 B.美國 C.丹麥

2．《海的女兒》中的小公主最后化成了（ ）A．泡沫 B.海水 C.海草 D.小精靈

3.《打火匣》中士兵用火擦打火匣，馬上出現(xiàn)了（ ）A. 巫婆 B.狗 C.公主

4．《賣火柴的小女孩》中的小女孩最后在亮光中看到了（ ）A.烤鵝 B.圣誕樹 C.奶奶 D.糖果

5.《野天鵝》中，妹妹編織（ ）救了十一位哥哥。A.披風 B.衣服 C.帽子 D.鞋子

6.《堅定的錫兵》中，只有一只腳的錫兵，最后變成了什么？（ ）A.錫塊 B.錫勺子 C.錫心 D.錫兵四、看圖寫話。（12分）

仔細看圖，接著開頭的話編個小故事。

花傘借給誰？ 小花貓有一把花傘。一天，下大雨了，青蛙、烏龜、小鴨、大公雞從它的門前走過。

一、識字寫字（53分）

1、端 希 朋 從 竹

2、碧、峰、影、廊 鴉、鷗、杜、雁 永、勇、奇、棋子

赤、翅、叢、從 專心致志 天長日久

3、菠、蘿 朗、腿 裙、衫 松、樹 4、塊 迷人 慢慢根 小巧 飛快

5、（1）黃燦燦 紅通通 （2）家家戶戶 高高興興

6、（1）表揚 （2）傳揚 （3）感動 激動 （4）茂密的 藍藍的 黃黃的 尖尖的

二、按課文內容完成練習。（23分） 1、寒暑 云月 生龍練功 六色 古今

2、（1）中秋 團圓 月餅 餃子 拜（2）眨眼 彎彎 荷塘 荷葉（3）隨風潛入夜，潤物細無聲。（4）狐貍 威風 安培 專心